臨床輸液反應(yīng)以熱原反應(yīng)危害最大，發(fā)生率最高。內(nèi)毒素（即革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖分子，lipopolysaccharide，LPS）注射即使是pg級(jí)別的痕量LPS也會(huì)導(dǎo)致病人嚴(yán)重的熱原反應(yīng)，引起人體發(fā)熱、休克甚至死亡。因此，靈敏可靠的內(nèi)毒素分析技術(shù)是非常必須的。
目前細(xì)菌內(nèi)毒素檢查主要依賴于鱟試劑，可分為凝膠法和光度測(cè)定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。
內(nèi)毒素的低回收率現(xiàn)象（Low Endotoxin Recovery,LER）是當(dāng)前經(jīng)常討論的話題。內(nèi)毒素低回收率是指對(duì)已經(jīng)添加細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的生物制藥產(chǎn)品采用藥典規(guī)定方法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)加標(biāo)內(nèi)毒素檢出失敗的現(xiàn)象，而這種現(xiàn)象通常表現(xiàn)為回收率過(guò)低，內(nèi)毒素被掩蔽。如果“內(nèi)毒素掩蔽”發(fā)生，意味著該內(nèi)毒素的活性形式（超分子結(jié)構(gòu)）發(fā)生了變化，從而檢測(cè)到的值要比實(shí)際低。因加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的藥品內(nèi)毒素回收失敗，生產(chǎn)過(guò)程中被內(nèi)毒素污染的含熱原產(chǎn)品會(huì)因內(nèi)毒素不能被檢出而被放行，導(dǎo)致含熱原的產(chǎn)品因用于商業(yè)用途而被患者使用的風(fēng)險(xiǎn)仍舊存在。
2013年，F(xiàn)DA開(kāi)始要求生物制品上市申請(qǐng)（Biologicslicensing applications，BLA）的申請(qǐng)人須提交在藥品中加入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品后，使用USP規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法可以檢出藥品中預(yù)加入的細(xì)菌內(nèi)毒素。在BLAs中關(guān)于內(nèi)毒素加標(biāo)試驗(yàn)及內(nèi)毒素保持時(shí)間的研究遇到了很大難點(diǎn)，這推動(dòng)FDA需要獲取更多信息或額外的研究來(lái)說(shuō)明。但是不同公司和不同研究的spike/hold study存在明顯的差異。
加標(biāo)樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素的檢出受樣品的制備方法影響（包括預(yù)處理及渦旋時(shí)間等），同時(shí)細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的類型、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的加入量、保持時(shí)間、被加標(biāo)樣品的溫度、內(nèi)毒素回收率的計(jì)算方式、檢查的執(zhí)行等均可引起測(cè)試結(jié)果的明顯差異，這增加了對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較和分析難度。等電點(diǎn)（Isoelectric points，pI)大于8或具有正電結(jié)構(gòu)的特定蛋白質(zhì)會(huì)束縛加入樣品中的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品從而引起LER。
內(nèi)毒素掩蔽是時(shí)間依賴性的，這意味著如果掩蔽發(fā)生，內(nèi)毒素的回收率隨時(shí)間降低。要降低低回收率現(xiàn)象，可以選擇具有足夠高濃度的樣品，然后進(jìn)行稀釋從而排除或減少干擾。
此外，除了回收率低這一現(xiàn)象，內(nèi)毒素檢測(cè)中也存在假陽(yáng)性這一問(wèn)題。這主要是因?yàn)槌藘?nèi)毒素，內(nèi)毒素檢測(cè)所用的鱟試劑還與某些β-葡聚糖反應(yīng)，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。科學(xué)研究表明，含有高濃度蛋白質(zhì)和聚山梨酯等非離子型表面活性劑的生物制劑結(jié)合使用后，往往會(huì)改變內(nèi)毒素分析物的聚集態(tài)，以至于內(nèi)毒素的檢測(cè)存在問(wèn)題。
鱟試劑是從鱟的血液中提取出的凍干試劑，可以與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)。2021年2月5日，《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄》將我國(guó)分布的鱟科動(dòng)物（中國(guó)鱟、圓尾蝎鱟）升級(jí)為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。這無(wú)疑對(duì)依賴鱟試劑的內(nèi)毒素檢測(cè)造成了影響。
2020版中國(guó)藥典《9251細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》提出，可使用重組C因子法進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。
重組C因子（rFC）內(nèi)毒素檢測(cè)是一種不依賴于動(dòng)物源性成分、靈敏度高、特異性高、可穩(wěn)定且持續(xù)提供的替代鱟試劑的內(nèi)毒素測(cè)定方法。
C因子是傳統(tǒng)鱟試劑中對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠選擇性地識(shí)別內(nèi)毒素。重組C因子利用基因重組技術(shù)表達(dá)的內(nèi)毒素特異性酶，被活化后可直接與熒光底物作用，產(chǎn)生與內(nèi)毒素濃度成正比的熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)定量。相對(duì)于傳統(tǒng)鱟試劑，重組C因子法可以為我們帶來(lái)以下優(yōu)點(diǎn)：
1、保護(hù)鱟資源
rFC方法無(wú)動(dòng)物源，保護(hù)了鱟資源，也符合現(xiàn)在3R保護(hù)理論，即對(duì)使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)應(yīng)替代、減少、優(yōu)化。
2、避免β-葡聚糖的干擾
傳統(tǒng)鱟試劑檢測(cè)方法由于存在旁路反應(yīng)（鱟試劑中的G因子在β-葡聚糖存在下也可以引起反應(yīng)），會(huì)造成假陽(yáng)性。而重組C因子方法從原理上就避免了這種干擾。
3、標(biāo)準(zhǔn)化
鱟血是個(gè)復(fù)雜的成分，不同個(gè)體、不同時(shí)間、地點(diǎn)采集的鱟血都會(huì)有所不同，這就造成了鱟試劑存在一定的批次間波動(dòng)。而重組C因子方法由于其可控的生產(chǎn)工藝，可以保證其批間穩(wěn)定性。使企業(yè)實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。
4、持續(xù)穩(wěn)定供給
對(duì)于內(nèi)毒素檢測(cè)的需求在急劇增加，但是鱟資源卻在急劇緊縮。這種供需關(guān)系也為鱟試劑的使用帶來(lái)的很大風(fēng)險(xiǎn)。重組C因子法基于其可無(wú)限重復(fù)的生產(chǎn)工藝，可以保證持續(xù)穩(wěn)定的供給。
2018年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了基于rFC試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)的藥物。這為rFC檢測(cè)方法的廣泛采用打開(kāi)了大門(mén)。作為一種合成試劑，rFC可以替代來(lái)源于鱟血液的美洲鱟試劑（LAL）和東方鱟試劑（TAL）用于內(nèi)毒素檢測(cè)。rFC試劑的主要優(yōu)點(diǎn)是提高了一致性和可持續(xù)性。變異是所有動(dòng)物源性產(chǎn)品的共同特征，合成的一致性可以使生產(chǎn)和檢測(cè)過(guò)程更容易控制，并且由于可以無(wú)限制地的生產(chǎn)rFC，從而更具可持續(xù)性。
參考文獻(xiàn)
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