納米抗體（VHHs）因其可通過工程改造直接在真核細胞和原核細胞中進行表達而成為有吸引力的抗體形式。利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建的免疫羊駝VHH庫，并從中篩選得到抗Fc VHHs，它們可以與人類抗體Fc段高親和力地結(jié)合。當用于標記產(chǎn)生mAb的CHO細胞時，GFP融合的anti-human Fc VHH-GFP產(chǎn)生的FACS信號明顯強于AF488連接的抗IgG抗體。此外，基于抗Fc VHH-GFP標記的CHO細胞的分選使高生產(chǎn)力的細胞系得以富集。相比傳統(tǒng)的動物來源熒光抗體，這種安全且具有成本效益的抗Fc VHH-GFP可用于優(yōu)化治療性mAb生產(chǎn)的高產(chǎn)細胞系的篩選過程。
高產(chǎn)細胞系的篩選和富集仍然是單克隆抗體（mAb）生產(chǎn)過程中面臨的巨大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的有限稀釋法是成熟和可靠的，但它耗時長，而且通量低。因此，一種高效和高通量的篩選方法就更加重要了。近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展，新型的單細胞篩選方法已經(jīng)被開發(fā)出來，以促進更有效地分離高產(chǎn)的克隆細胞，如單細胞分析和分離系統(tǒng)，包括：
1）基于細胞表面顯示技術(shù)的無標簽篩選方法，微流控技術(shù)和Beacon平臺；
2）利用ClonePix? Systems分析生長在半固體中的細胞，并通過克隆熒光顯微鏡進行挑選。
研究結(jié)果表明，分泌的蛋白質(zhì)會被短暫截留在細胞表面，并且與細胞分泌的蛋白質(zhì)的量相關(guān)，這為使用流式細胞儀和細胞分選來分離出稀有的高產(chǎn)細胞提供了啟發(fā)。熒光激活細胞分選（FACS）根據(jù)測定的熒光水平對細胞進行篩選，已被證明是高效且有效的。然而，在篩選過程中使用的抗IgG熒光抗體來自于動物源，導(dǎo)致人們對生物制藥生產(chǎn)中的生物安全性產(chǎn)生擔憂。因此，尋求一種重組抗體用于細胞標記，并從轉(zhuǎn)染的細胞系中選擇高產(chǎn)的亞克隆，顯得尤為重要。研究表明，單鏈可變片段（scFv）和綠色熒光蛋白（GFP）的融合抗體可以在流式細胞儀中直接標記細胞，避免了抗原結(jié)合能力的喪失，減少了背景染色。與scFv相比，VHH在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、分子量、表達產(chǎn)量、DNA操作和文庫構(gòu)建的便利性方面具有更多優(yōu)勢。
利用VHH-GFP篩選出可高表達抗Her2 mAb的重組CHO細胞系。通過噬菌體展示技術(shù)篩選出抗Fc的VHH，以GFP融合標簽的形式在大腸桿菌中進行表達和生產(chǎn)。純化后的VHH-GFP可用來標記CHO細胞，并以熒光強度為標準分離出高產(chǎn)細胞系。最后，檢測不同亞克隆中抗Her2 mAb的表達水平。通過與傳統(tǒng)的熒光抗體（Goat anti-human IgG(H+L) antibody, Alexa Fluor 488）的對比，評估VHH-GFP在分選高產(chǎn)細胞系的可行性。
用F. sight分別對VHH-1-GFP或AF488標記的細胞進行分選。VHH-1-GFP標記（圖1，B）的細胞系的熒光強度明顯高于AF488標記的傳統(tǒng)抗體（圖1A）的熒光強度。單個細胞系的熒光值對比展示在圖1C。
在分選過程中，設(shè)置條件包括熒光強度最高的30%的細胞，并且大于12微米，圓度為0.6～1，以排除不能增殖的和不規(guī)則形狀的細胞。隨后將分選的細胞置于96孔板中培養(yǎng)（1個細胞/孔），20天后通過ForteBio定量分析抗Her2 mAb的表達情況。經(jīng)VHH-1-GFP分選的亞克隆的平均mAb濃度為15.75 mg/L，最高值為28 mg/L，而經(jīng)AF488共軛山羊抗體篩選的亞克隆的平均值為9.14 mg/L，最高值為17.8 mg/L（圖2）。這些數(shù)據(jù)證實了VHH-1-GFP可用于流式細胞儀分選，并有效富集高mAb表達的CHO細胞。
瑞諾生物提供Rhinogen?重組抗人IgG（Fc）納米抗體- Fluorescein標簽，可特異性識別4種人IgG并具有超高親和力，其中Fluorescein標簽可由480nm激光激發(fā)，并在510nm發(fā)射?？捎糜诹魇郊毎治觯‵low）、免疫熒光（IF）、免疫細胞化學（ICC）、免疫組化（IHC）等，特別的可配合流式細胞分選儀、ClonePix? Systems、F.sight?單細胞篩選儀用于高表達IgG克隆篩選，在短時間得到大量高表達克隆。
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