單克隆抗體藥物的體外生物學(xué)活性檢測是對抗體類藥物有效成分以及效價進行測定，是單抗藥物質(zhì)量控制中非常重要的一環(huán)，生物學(xué)活性檢測貫穿蛋白藥物整個生命周期，從早期靶點的發(fā)現(xiàn)，抗體的篩選，再過渡至CMC階段進行生產(chǎn)、臨床應(yīng)用，到最后上市，都會涉及生物活性的分析。因此，選擇高效、快速、準(zhǔn)確的生物活性測定方法是極其重要的。
?下面我們以抗體藥物為例，說明生物學(xué)活性方法主要包括哪些。
1）細胞增殖抑制法
MTT法
CCK-8法
刃天青法
ATP法
ATP發(fā)光法是利用螢火蟲熒光素/熒光素酶與細胞內(nèi)的ATP發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生光子，通過檢測光度來得到ATP含量，從而分析細胞活性與增殖情況。具有靈敏度高、操作便捷等優(yōu)點。
報告基因法是通過重組抗體與相應(yīng)靶點結(jié)合后，測定信號通路變化效應(yīng)的活性評價方式。一般在細胞株難于獲得，以及殺傷中和或增殖抑制法產(chǎn)生量效曲線的信噪比不理想時，可基于對該通路的現(xiàn)有了解，將攜帶抗體作用靶點反應(yīng)元件與報告基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞后，通過重組抗體與相應(yīng)靶點的作用，啟動報告基因的表達來檢測重組抗體的生物學(xué)活性。
單抗類藥物的ADCC活性檢測的傳統(tǒng)方法是外周血單核細胞（PBMC）或自然殺傷細胞（NK）對靶細胞的殺傷實驗，這種方法細胞分離難度大、實驗操作復(fù)雜并且變異性大。近年來國內(nèi)外建立了基于報告基因法的ADCC活性檢測方法，完善了此類藥物的活性檢測方法。
除了檢測抗體對細胞的增殖和毒性作用外，還可以通過ELISA法測定靶細胞與抗體及刺激因子共培養(yǎng)后分泌的細胞因子來評價抗體的生物學(xué)活性。例如抗IL-17單抗可以根據(jù)其抑制IL-17誘導(dǎo)靶細胞釋放IL-6或GROα等細胞因子的能力來評價其生物學(xué)活性。將IL-17和IL-17單抗以及靶細胞接種到96孔板上，培養(yǎng)過夜。再通過ELISA法定量測定細胞上清液中分泌的細胞因子的含量，細胞因子的含量與抗體活性成反比。
基于SPR的BIA法測定周期短；樣品消耗量低，一般僅有微克級；另外，無需預(yù)先標(biāo)記熒光、二抗的分子，避免了標(biāo)記基團對分子構(gòu)象的影響，從而反映出分子間真實的結(jié)合性質(zhì)；該技術(shù)除了獲取一般的親和力信息外，還能夠給出對闡述分子間結(jié)合機理更為寶貴的動力學(xué)信息。SPR 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于小分子制藥和生物制藥領(lǐng)域，在抗體分析領(lǐng)域，其應(yīng)用主要包括：
隨著技術(shù)的進步，藥物體外生物學(xué)活性檢測手段越來越多，比如均相時間分辨熒光、Alpha技術(shù)、熒光染料標(biāo)記法等。一種藥物往往可通過多種方法進行體外活性的測定，例如：以VEGF或VEGFR2為靶點的單抗類藥物的生物活性測定方法包括增殖抑制法和報告基因法。一種被廣泛應(yīng)用的方法是人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human umbilical vein endothelial cell,）增殖抑制法，但是這種方法變異性大，重復(fù)性差。一種基于VEGF的主要作用機理VEGF-VEGFR-NFAT途徑的報告基因法，該方法通過檢測熒光素酶化學(xué)發(fā)光信號對其生物學(xué)活性進行檢測，可以作為HUVEC增殖抑制法的可行補充方法，并用于其它種類的抗VEGF抗體的效力測定。
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參考文獻