治療性單克隆抗體屬于IgG類，含有N-連接寡糖。典型的IgG類抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，它們形成三個不同的結構域，包括兩個相同的Fab（抗原結合）結構域和一個Fc結構域。Fc 結構域是重鏈的同源二聚體，在Asn-297位置帶有N-糖基化保守位點。Fc結構域與免疫細胞表面的Fc受體(FcγR)結合來參與免疫細胞的募集，并直接啟動免疫反應，包括吞噬作用、免疫細胞激活和細胞因子對抗原展示靶點的刺激。Fc結構域的糖基化介導與FcγR的相互作用并調節(jié)抗體依賴性效應器功能，包括抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)，其包含激活自然殺傷細胞以啟動癌細胞的裂解，和補體-依賴性細胞毒性（CDC），它涉及靶細胞裂解的啟動和補體途徑的部署。
研究表明，IgG的Asn297的聚糖含有的核心巖藻糖或末端唾液酸會降低IgG對Fcγ受體的親和力。無論是敲除編碼α1,6-巖藻糖基轉移酶 (Fut8) 的基因還是過表達編碼GnT-III轉移酶 (Mgat3) 的基因都會導致Asn297缺乏核心巖藻糖基化，可以提高把IgG對FcγRIIIa 的親和力，從而增強ADCC效應。因此單克隆抗體的糖基化修飾分析至關重要。
從廣義上講，治療性蛋白質的糖基化分析可以在三個水平上進行，即完整蛋白質、糖肽和釋放的聚糖。
圖片來源Challenges of glycosylation analysis andcontrol: an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs
有多種分析方法可在完整蛋白質水平上進行表征，包括色譜、電泳、MS和其他光譜技術。由于卓越的分辨率，MS已成為在開發(fā)過程的許多階段表征 mAb的關鍵分析工具，質譜分析常用的離子化技術為MALDI和ESI,二者均為軟電離技術，具有很強的互補性，并兼具高通量、高分辨率、高靈敏度等特點，但由于離子化可能引起唾液酸殘基等不穩(wěn)定糖苷鍵的斷裂，分析前需要對糖鏈進行(全)甲基化衍生或對唾液酸殘基進行衍生保護。其中，MALDI是一種快速、簡單的糖鏈離子化方法，對鹽等干擾物的耐受力強，因電離產生的離子多為單電荷而便于解析。另外可以通過高分辨率質量分析儀，包括ToF、Orbitrap和傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)儀器來解決小的質量差異。
在質譜分析過程中，糖肽因結構復雜、分子質量大、離子化效率低、殘留多肽干擾而較糖鏈分析更加困難。目前報道的糖肽分析方法主要有一級質譜（MS1）和串聯(lián)質譜（MS2）。一級質譜水平的糖肽分析：糖肽在MS1水平的直接鑒定依賴于高分辨質譜儀采集糖肽精確分子質量的同位素分布數(shù)據(jù)。在多肽中，其主要組成元素為C、H、N 等(同位素間均只有1 u差異)。然而，糖肽中含有較多的氧元素，自然界中16O與18O之間存在2 u差異。因此，其特征性的同位素峰型在理論上可以用于糖肽的識別和鑒定，但對質譜儀的性能要求較高。MS2水平的糖肽分析：糖肽的鑒定一般通過串聯(lián)質譜結合數(shù)據(jù)庫搜索進行確定。常見的串聯(lián)質譜碎裂方式有碰撞誘導解離（CID）、高能碰撞解離（HCD）、電子轉移解離（ETD）。CID碎裂技術能量較高，糖肽裂解作用于肽鏈上的聚糖，產生一系列與聚糖裂解有關的碎片離子。然而，因糖肽的分子質量較大，CID-MS2圖譜無法檢測到氧鎓離子信號，不利于糖肽MS2譜圖的解析。
聚糖的釋放可采用生物酶解和化學水解的方法。N-糖苷酶F(PNGase F)、N-糖苷酶A(PNGase A)、糖苷內切酶H(Endo H)和糖苷內切酶S(Endo S) 是常用的從蛋白質氨基酸鏈上酶解聚糖的糖苷酶。PNGase F可用于糖肽或完整蛋白上連接的聚糖釋放，然后可以利用一系列酶包括：尿素節(jié)桿菌唾液酸酶 (ABS)、牛睪丸β-半乳糖苷酶 (BTG)、牛腎 α-巖藻糖苷酶 (BKF)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（GUH）聯(lián)合作用，根據(jù)外切糖苷酶的特異性，可以將共洗脫的聚糖分開。
為提高檢測的靈敏度，基于HPLC的聚糖分析工作流程通常包括聚糖的熒光標記。一些熒光標簽已連接到N-聚糖上，例如 2-氨基苯甲酰胺 (2-AB) 和 2-氨基苯甲酸 (2-AA)。使用HILIC作為分離模式和使用熒光標記的葡聚糖作為標準物質，不同的操作人員可以在不同的系統(tǒng)上進行快速且高度可重復的完成糖鏈分析。糖鏈的分析可從RP-HPLC和CE-LIF平臺收集的數(shù)據(jù)，專用實驗數(shù)據(jù)庫（即Glycobase），以及通過HILIC-HPLC/UPLC分析的大量聚糖種類的歸一化保留時間值（GU值），再加上外切糖苷酶陣列消化如下圖，可以使結構分配相對簡單。
使用N-聚糖的外切糖苷酶陣列消化確定單糖組成和連接，本實驗中使用的一系列酶包括：尿素節(jié)桿菌唾液酸酶 (ABS)、牛睪丸 β-半乳糖苷酶 (BTG)、牛腎 α-巖藻糖苷酶 (BKF)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（GUH）。根據(jù)外切糖苷酶的特異性，可以將共洗脫的聚糖分開。
蛋白質的糖基化是一種重要的翻譯后修飾，糖基化蛋白中的寡糖為非模板合成，并呈復雜的樹枝狀結構，據(jù)報道僅由6種單糖組成的寡糖鏈，其理論結構即達到驚人的1012種。宿主細胞、生產工藝等各種影響因素更增加了糖基化修飾結構的復雜性。因此選擇合適的方法及工具酶對蛋白質的糖基化修飾進行表征尤為關鍵。
參考文獻
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