介 紹
在制藥和醫(yī)療器械生產(chǎn)過程中，對污染物樣品的監(jiān)測是一個(gè)關(guān)鍵步驟。內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中，是一種常見的污染物，可引起發(fā)燒、炎癥、頭痛、惡心，甚至死亡。
內(nèi)毒素的常規(guī)檢測方法是鱟試劑溶酶法（LAL），核心成分由鱟的血液中提取而來。在內(nèi)毒素存在的情況下，LAL 通過酶促級聯(lián)凝固，可以通過比濁法或顯色法定量（圖 1 A）。這些方法涉及多個(gè)酶的步驟，并受限于鱟資源的多少。
2021 年 2 月 5 日，國家林業(yè)和草原局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布公告，調(diào)整后的?國家重點(diǎn)保護(hù)野生動物名錄?正式發(fā)布，將我國分布的鱟科動物（中國鱟、圓尾蝎鱟）升級為國家二級保護(hù)動物。
中國藥典 2020 年版 9251 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中指出，目前新的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法不斷出現(xiàn)，以適應(yīng)特殊品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的需要，或減少鱟試劑的使用量。如重組 C 因子法（見附）、微量凝膠法等。
附：重組C 因子法
C 因子是鱟試劑中對細(xì)菌內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識別內(nèi)毒素。重組 C 因子是一種人工合成的 C 因子，它被細(xì)菌內(nèi)毒素活化后，可與熒光底物作用產(chǎn)生與內(nèi)毒素濃度成比例的熒光信號。
本法系依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其孵育終止時(shí)的熒光值之間存在量化關(guān)系來測定細(xì)菌內(nèi)毒素的含量。本法為終點(diǎn)熒光法。依據(jù)檢測原理，本法不存在 G 因子旁路干擾，具有較高的專屬性，因此適合于含有 β- 葡聚糖干擾的樣品檢測；本法所用試劑不含有 B 因子和凝固酶原、凝固蛋白原等，因此，含有對上述物質(zhì)抑制或增強(qiáng)作用的樣品適合使用重組 C 因子法。
重組 C 因子法試驗(yàn)需采用熒光酶標(biāo)儀，其激發(fā)和發(fā)射波長等參數(shù)參照試劑的使用說明書，激發(fā)/發(fā)射波長一般為 380nm/440nm，檢測溫度一般為 37°C ±1°C 。
圖 1 酶促級聯(lián)反應(yīng) LAL（A）和重組 C 因子 rFC 分析（B）。rFC 分析包括一個(gè)一步的酶聯(lián)反應(yīng)，消除了對鱟的需要，同時(shí)避免葡聚糖引起的 G 因子非特異性干擾造成的假陽性。
圖 2 當(dāng)葡聚糖存在時(shí)，LAL 顯色法和 rFC 法反應(yīng)特異性比較。
材料
方 法
① 取用 4 支一次性無熱原安瓿瓶，在瓶身標(biāo)明內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（分別 0.005、0.05、0.5及5EU/ml），用溶解至 20EU/ml 的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備系列內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
② 提前將微孔板讀板機(jī)的溫度設(shè)置為37℃待用。將 100μl 陰性對照（無熱原水）、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品（兩組）分別加入到 96 孔無菌無熱原白板相應(yīng)孔中，兩復(fù)孔。兩組樣品中分別加入 10μl 0.5EU/ml 的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為加標(biāo)樣品組。加樣后的 96 孔板在 37°C ± 1°C 的微孔板讀板機(jī)中，預(yù)熱 10-20 分鐘。
③ 微孔板預(yù)熱時(shí)，配置底物試劑。按照 5:4:1 的比例混合熒光底物溶液、測定緩沖液和 rFC 酶溶液，輕輕地充分混合，切勿漩渦混合。
④ 設(shè)置讀板參數(shù)：
激發(fā)/發(fā)射波長設(shè)置為 380/440nm，PMT Gain 設(shè)置成 Automatic，頂讀。以 i3x 為例，酶標(biāo)儀讀板設(shè)置如下圖所示。
取出預(yù)熱的 96 孔板，向所有樣品孔中加入 100μl/ 孔底物試劑。
讀取 0h 的相對應(yīng)熒光強(qiáng)度 T0，將微孔板繼續(xù) 37°C ± 1°C 孵育 1h，讀取 1h 的相對熒光強(qiáng)度 T1。
⑤ 數(shù)據(jù)分析：
以內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，凈 ΔRFU 為縱坐標(biāo)繪圖并進(jìn)行 Log-Log 擬合，log(ΔRFU) = A*log(內(nèi)毒素濃度 EU/ml)+B
說明：
所有孔的 ΔRFU=T1-T0
標(biāo)準(zhǔn)品/樣品的凈 ΔRFU= 標(biāo)準(zhǔn)品/樣品的ΔRFU-陰性對照 ΔRFU
結(jié) 果
Molecular Devices 的 4 款微孔板讀板機(jī)，SpectraMax M2e、SpectraMax M5e、SpectraMax iD3 和 SpectraMax i3x 均符合重組 C 因子試劑盒檢測要求。我們已根據(jù)Rhinogen? 重組 C 因子內(nèi)毒素檢測試劑盒的說明書編輯了統(tǒng)一的模板，直接調(diào)用模板即可讀數(shù)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線以內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，凈 ΔRFU 為縱坐標(biāo)繪圖并進(jìn)行 Log-Log 擬合。標(biāo)準(zhǔn)品有 5 個(gè)梯度（0，0.005 EU/ml，0.05 EU/ml，0.5 EU/ml，5EU/ml），每個(gè)樣品 2 復(fù)孔。所有 4 款型號儀器的 R2 值都在 0.998以上，加標(biāo)回收率也都在中國藥典 2020 版要求以內(nèi)。具體數(shù)據(jù)如下，
圖 3 SpectraMax M2e， 標(biāo)準(zhǔn)曲線 R2 值 0.999
圖 4 SpectraMax M5e ，標(biāo)準(zhǔn)曲線 R2 值 0.999，兩個(gè)樣品加標(biāo)回收率分別為 110% 和 120%
圖 5 SpectraMax iD3，標(biāo)準(zhǔn)曲線 R2 值 0.998，兩個(gè)樣品加標(biāo)回收率分別為 82% 和 98%
圖 6 SpectraMax i3x，標(biāo)準(zhǔn)曲線 R2 值 1.000，兩個(gè)樣品加標(biāo)回收率分別為 102% 和 113%
結(jié) 論
Molecular Devices的4款多功能微孔板讀板機(jī)，SpectraMax M2e、SpectraMax M5e、SpectraMax iD3和SpectraMax i3x均能夠進(jìn)行重組C因子檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線展現(xiàn)了完美的線性，SpectraMax i3x R2值達(dá)到了1.000。3款儀器樣品2復(fù)孔CV值小于5%，展現(xiàn)了優(yōu)異的復(fù)孔重現(xiàn)性；加標(biāo)回收率在82%~113%之間，明顯優(yōu)于中國藥典2020版要求50%~200%的范圍。
SoftMax Pro 軟件可用于分析數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，自動計(jì)算生成 R2和CV值，調(diào)用預(yù)先設(shè)置好的模板可以自動計(jì)算出樣品的加標(biāo)回收率并作結(jié)果判讀。