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瑞諾知識分享 || rFC法的適用性研究

發(fā)布時間： 9/22/2022 2:53:18 PM

自從第一個皮下注射液上市以來，注射熱很可能是注射的結(jié)果。現(xiàn)在，人們將引起恒溫動物體溫異常升高（發(fā)燒、休克或死亡等）的致熱物質(zhì)，稱為熱原，可能是造成大多數(shù)早期發(fā)燒和腸外注射描述的其他附帶生物效應的原因。熱原包括內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素熱原(NEP)，細菌內(nèi)毒素是最常見的熱原，也是醫(yī)藥工業(yè)界安全生產(chǎn)所關(guān)心的問題。注射時，即使是微量的熱原，也會通過稱為Toll樣受體(TLR)的一類蛋白質(zhì)觸發(fā)先天免疫反應。TLR是跨膜蛋白，主要在巨噬細胞和樹突狀細胞等所謂的前哨細胞中表達，它們在先天免疫系統(tǒng)的激活中起著至關(guān)重要的作用。它們充當模式識別受體，由對微生物或病原體相關(guān)分子模式以及內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式的識別觸發(fā)。迄今為止，已知13種人類TLR，每一種都充當一種或幾種特定配體的受體。這種結(jié)合觸發(fā)了細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應，作為對潛在有害微生物或其他外源性物質(zhì)的第一反應的基礎(chǔ)（圖1）。

兔熱原測試(RPT)于1942年推出，是第一個也是唯一一個用于檢測藥物和醫(yī)療產(chǎn)品中熱原的體內(nèi)方法，到目前為止，非腸道給藥的產(chǎn)品一般都以這種方式進行測試。RPT存在各種限制，例如：無法區(qū)分不同的內(nèi)毒素和NEP；對疫苗等固有致熱藥物的反應只能定性；無法應用于非靜脈內(nèi)給藥的藥物；動物飼養(yǎng)和用于測試所需要投入較多時間和精力；而且最重要的是無法定量分析。

基于鱟變形細胞裂解物（LAL）的內(nèi)毒素檢測于1977年被美國FDA批準，之后幾年陸續(xù)被其他主流藥典批準。在藥物質(zhì)量控制中，有三種主要的LAL方法用于檢測和/或定量內(nèi)毒素，根據(jù)它們的檢測機制命名。雖然它們是不同的方法，但它們都利用鱟試劑來檢測內(nèi)毒素，并依賴于相同的凝血級聯(lián)原理（圖2）。凝膠法是最原始的鱟試驗，也是目前藥典認可內(nèi)毒素檢測的“金標準”。這是一種定性檢測方法，其中凝膠的凝結(jié)表明樣品中存在高于裂解物靈敏度的內(nèi)毒素。其他兩種方法，比濁法和顯色法，都是通過標準曲線實現(xiàn)定量分析。比濁法LAL測試將凝膠化速率（濁度）聯(lián)系起來，以確定樣品的內(nèi)毒素濃度。顯色LAL測試使用一種合成顯色底物，該底物添加到試劑中并被凝血酶激活，從而產(chǎn)生比色讀數(shù)。

LAL采用海鱟血液作為生產(chǎn)原料，由于季節(jié)、地域等差異，使得LAL的批次差異成為常見現(xiàn)象。LAL還含有許多其他蛋白質(zhì)（其中至少十種參與抗微生物反應），這些蛋白質(zhì)可以抑制或增強活性，例如通過檢測β-葡聚糖和纖維素殘基激活LAL級聯(lián)的G因子蛋白。然而，LAL方法的主要限制與其來源有關(guān)。該過程需要對動物鱟進行放血，即使通過采集少量血液便放生和標記，這一過程對動物來說也并非沒有風險，據(jù)統(tǒng)計死亡率可高達30%以上。除了立法也有明顯的倫理問題外，還有許多關(guān)于這些生物的長期生存能力的問題，以及由于它們的數(shù)量減少導致的環(huán)境問題。

第一個市售的基于重組因子C(rFC)的內(nèi)毒素檢測方法（BET）于2004年面世（圖2）。從那時起，其他rFC試劑也逐步進入市場，以提高可用性以及產(chǎn)品和供應商的范圍。rFC檢測使用單一重組蛋白，因子C和小熒光肽作為檢測試劑的一部分。與其他重組生產(chǎn)的產(chǎn)品一樣，其生產(chǎn)標準化主要為控制生產(chǎn)相同的rFC蛋白，并且已有實驗證明rFC比LAL批次間的可重復性高（表1)。另外，rFC檢測也不包含因子G，因此，它可以避免葡聚糖引起的G因子非特異性干擾所造成的假陽性。

由于潛在的干擾，蛋白質(zhì)樣品中內(nèi)毒素的檢測可能具有挑戰(zhàn)性。輝瑞公司2013年利用所有市售鱟試劑測試方法（凝膠法、動力學比濁法、動力學顯色和終點顯色）以及rFC檢測了13個具有代表性的生物蛋白質(zhì)樣品（圖3）。在所有定量分析中，10個樣品的內(nèi)毒素水平都可測量，rFC和LAL之間的檢測結(jié)果差異不大。

裴宇盛等人進行了rFC產(chǎn)品的適用性。在四個實驗室的每一個都測試了三批六種不同藥品的適用性和干擾性。六個具有代表性的品種為：抗生素、生化藥物、重組原藥、中藥注射劑、病毒疫苗和單克隆抗體。研究得出的結(jié)論是，rFC對六種藥品具有良好的適用性；所有18批次的加標回收率結(jié)果均在中國藥典要求的50-200%的可接受范圍內(nèi)，并滿足干擾測試要求。研究數(shù)據(jù)還用于支持中國藥典在其最新更新中將rFC方法納入BET。

Muroietal，比較了LAL和rFC測定法在具有復雜基質(zhì)的人體疫苗的內(nèi)毒素檢測。該研究比較了四種不同的檢測方法：兩種LAL檢測方法和兩種基于rFC的檢測方法。測試的藥品包括：

1）含有蛋白酶的減毒活病毒疫苗；

2）對內(nèi)毒素檢測沒有干擾的滅活病毒疫苗；

3）可能含有來自其所含革蘭氏陰性抗原的天然內(nèi)毒素成分的一種滅活疫苗；

4）具有紅色的滅活病毒疫苗，可能干擾經(jīng)典LAL顯色動力學測定中的黃色終點判定。

結(jié)果表明，基于rFC的內(nèi)毒素檢測方法適用于四種不同基質(zhì)特征的產(chǎn)品中的內(nèi)毒素檢測。所有方法的參考標準均是要求內(nèi)毒素(RSE)加標回收率(100EU/ml)在50–200%范圍內(nèi)。該研究得出結(jié)論，LAL和rFC檢測都足以測試和放行四種疫苗產(chǎn)品。

隨著科學的進步，重組生產(chǎn)的治療性蛋白質(zhì)和肽類藥物已經(jīng)系統(tǒng)地取代了動物提取物。蛋白質(zhì)的天然提取物和重組蛋白在功能、效用上的等同性是生物技術(shù)革命的基礎(chǔ)。因此rFC的發(fā)展不是對LAL的挑戰(zhàn)，而是對LAL的傳承與創(chuàng)新。另外，rFC法能夠消除與鱟試劑相關(guān)的許多制約性，例如批次間的變異性；rFC試劑的主要原材料是基因重組表達生產(chǎn)，可穩(wěn)定的大批量持久供應，不受天然原材料來源的限制；rFC法的使用也符合3R 原則（替換、減少、改進），這將為動物和人類帶來持久的利益。因此未來幾年內(nèi)，rFC法有望成為替代LAL的主流內(nèi)毒素檢測法而被納入各國藥典正式方法。

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參考文獻

[1] Tindall,B.,Demircioglu, D., & Uhlig, T. (2021). Recombinant bacterial endotoxin testing: a proven solution. BioTechniques, 70(5), 290-300.